ГАЗОВЫЕ КРИОПРОТЕКТОРЫ

Одна из актуальных задач исследователей НТЦ КБА - определение потенциала клатратных гидратов в криосохранении. 

Опыты с клатратообразующими веществами

При контакте с водой ксенон при температуре ниже –1.6°C при атмосферном давлении образует клатрат – вещество, в котором молекулы воды образуют пространственный каркас, а атомы ксенона располагаются в полостях этого каркаса (Claussen 1951; Stackelberg and Müller 1951). Благодаря такому свойству, ряд авторов предложили использовать ксенон как криопротектор, связывающий воду в клатратах и предотвращающий, тем самым, образование льда (Prehoda 1969; Rodin, Isangalin et al. 1984; (Shcherbakov, Tel’pukhov et al. 2004; Sheleg, Hixon et al. 2008). Мы проводили опыты по криопротекции ксеноном и другими газами (далее газовая смесь № 1 и газовая смесь № 2)  на культурах пекарских дрожжей (S. cerevisidae)  и клеток млекопитающих, на мотыле и дафниях.

Также мы провели компьютерное моделирование взаимодействие ксенона с водой при разных температурах.  

Результаты экспериментов с S. cerevisidae

Дрожжи являются удобным объектом для изучения криоконсервации, поскольку криопроекторными эффектами для них обладает множество веществ (Breierova and Kockova-Kratochvilova 1992), вплоть до этанола с метанолом (Lewis, Learmonth, et al. 1994). Криоконсервация дрожжей проводилась по стандартным протоколам (Kruuv, Lepock, et al. 1978; Rowe and Lenny 1980; Wellman and Stewart 1973) с  ксеноном или газовой смесью № 1 вместо общепринятых криопроекторов.

Мы установили, что для дрожжей ксенон обладает криопротекторным эффектом при всех опробованных давлениях от 3 до 7 ат. При 6 ат ксенона выживаемость клеток составила 68.5±6%, что сравнимо с эффектом глицерина или ДМСО (50±25%). Без криопротекторов выживаемость дрожжей (определяемая методом дифференциальной окраски трипановым синим) была порядка 20-40%. Совместное применение глицерина или диметилсульфоксида с ксеноном синергетического эффекта не дало – выживаемость оказалась в среднем 71±15%.

Результаты по клеточным культурам (размораживание без декомпрессии)

В отличие от дрожжей, которые замораживались по простому протоколу, для культур клеток млекопитающих мы использовали градиентную заморозку (охлаждение на 1°С/ мин до -80°С ), которая ранее хорошо показала себя в нашей лаборатории, давая клеточную выживаемость не менее 85%, а чаще даже более 90% клеток.

Как оказалось, в экспериментальной группе в препаратах, замороженных с ксеноном при давлении более 3 ат любого протокола градиентной заморозки, во время разморозки имело место сильное пенообразование, а при микроскопии целые клетки не находились, а тем более – жизнеспособные. Вне зависимости от состава среды, наличия/отсутствия ДМСО и эмбриональной телячьей сыворотки и т. д.

В препаратах, замороженных с ксеноном при 2,5-3 ат, после размораживания микроскопически определялись части клеток, но, вне зависимости от наличия криопротекторов, все они были мертвы, на вид в лучшем случае полуразрушенные, напоминающие "тени эритроцитов" при лизисе.

Эти результаты заставили нас провести дополнительные исследования по определению поведения клатратов (см. раздел «Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой»).

Результаты экспериментов с дафниями

В данной серии опытов мы использовали вместо ксенона газовую смесь № 2, которая способна образовывать гидраты при тех же условия, что и ксенон. Согласно гипотезе клатратного анабиоза, можно использовать любые клатратообразующие инертные газы для получения клатратного анабиоза.

В отдельных опытах мы убедились, что газовая смесь № 2 не токсична для дафний. После серии предварительных опытов мы нашли оптимальные условия образования гидратов газовой смеси № 2 как в воде, так и в самих дафниях, а затем научились удалять газ без образования пузырьков в телах дафний.

Однако, нам не удалось наблюдать живых дафний при самых оптимальных процедурах образования и разрушения газовых гидратов смеси № 2. Мы планируем повторить эти опыты с применением ксенона.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Нами проведён большой объём молекулярно-динамических расчётов поведения растворённого в воде ксенона при температурах около 0°С и ниже. Получены значения температур и концентраций, при которых происходит выпадение из раствора кристаллогидратов ксенона или, наоборот, его разложение. Полученные результаты позволили найти режим согревания, при котором гидраты ксенона разлагаются без образования газовой фазы – пузырьков, разрушающих клетки.


Было также проведено моделирование роста кристаллов льда в водном растворе ксенона. Выяснилось, что рост кристалла (и возрастание концентрации ксенона в окружающей воде) происходит до тех пор, пока концентрация не достигнет достаточно высоких значений; после этого рост кристалла прекращается, а остающийся раствор представляет собой аморфный гидрат ксенона.

На основании вышеописанного мы сделали следующие выводы: чтобы клетки остались целыми и жизнеспособными, необходимо, во-первых, разрушать клатрат при таком давлении, когда выделяющийся газ может целиком раствориться в окружающей жидкости. Во-вторых, после размораживания проводить постепенную декомпрессию, причем во время нее обеспечить как можно меньшую концентрацию ксенона во внеклеточном пространстве для большего облегчения выхода ксенона из клеток без перехода в газовую фазу.

В развитие данного исследования представляется важным смоделировать поведение ксенона и других инертных газов:

  • при более низких температурах (потребуется ещё бóльший объём вычислений);
  • в присутствии NaCl и других веществ, характерных для живой материи;
  • в присутствии стандартных криопротекторов;
  • в клеточных мембранах (есть основания считать, что инертные газы могут являться эффективными мембранопротекторами).

Результаты по клеточным культурам (декомпрессия после размораживания)

На основании сделанных компьютерного моделирования и опытов с мотылем был создан дополнительный балластный объем (примерно 150 мл), монтируемый на криобарокамеру, а перед согреванием в охлажденную барокамеру добавлялся гелий при давлении 8-10 ат. После чего криобарокамера в течение 2-3 мин. согревалась на водяной бане при 37°С, затем переносилась в емкость с водою комнатной температуры, в которой и проводилась декомпрессия длительностью 30-50 мин.

В результате, после такой декомпрессии у клеток, замороженных с ксеноном с добавлением традиционных криопротекторов (ДМСО, глицерин) появилась сравнимая с безксеноновым (азот при тех же давлениях) контролем выживаемость клеток при всех опробованных давлениях, в среднем  60±25%. Примечателен тот факт, что, как и в случае дрожжей, само по себе повышенное давление на выживаемость культур клеток млекопитающих не влияет.

К сожалению, у клеток, замороженных по градиентным протоколам только с ксеноном, выживаемость была нулевая. Хотя сами клетки были целыми, оформленными, но – мертвыми.

К нашему удивлению, контрольные эксперименты дали совершенно другие результаты. Препараты, замороженные по “дрожжевому протоколу” (2 ч. при -20°С, погружение барокамеры в жидкий азот) с 7 ат ксенона, показали клеточную выживаемость в 2,8±2,3% (от 0,5% до 8,1%). Препараты, замороженные по тому же протоколу с 6 ат газовой смеси №1 – 2,4±0,9% (от 1,6% до 4,4%). А препараты с разными вариантами ”шоковой заморозки” (максимально быстрое охлаждение от  0°С до -196°С путем погружения барокамеры в  жидкий азот) с 7 ат ксенона дали выживаемость соответственно в 10,5±4,4% и 22,5±13,4%

Все вышеперечисленное говорит о том, что применение газовых криопротекторов оказалось потенциально весьма перспективным, но требует разработки новых протоколов заморозки и программной декомпрессии.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Нами проведён большой объём молекулярно-динамических расчётов поведения растворённого в воде ксенона при температурах около 0°С и 

ниже. Получены значения температур и концентраций, при которых происходит выпадение из раствора кристаллогидратов ксенона или, наоборот, его разложение. Полученные результаты позволили найти режим согревания, при котором гидраты ксенона разлагаются без образования газовой фазы – пузырьков, разрушающих клетки.

Было также проведено моделирование роста кристаллов льда в водном растворе ксенона. Выяснилось, что рост кристалла (и возрастание концентрации ксенона в окружающей воде) происходит до тех пор, пока концентрация не достигнет достаточно высоких значений; после этого рост кристалла прекращается, а остающийся раствор представляет собой аморфный гидрат ксенона.

На основании вышеописанного мы сделали следующие выводы: чтобы клетки остались целыми и жизнеспособными, необходимо, во-первых, разрушать клатрат при таком давлении, когда выделяющийся газ может целиком раствориться в окружающей жидкости. Во-вторых, после размораживания проводить постепенную декомпрессию, причем во время нее обеспечить как можно меньшую концентрацию ксенона во внеклеточном пространстве для большего облегчения выхода ксенона из клеток без перехода в газовую фазу.

Добавить комментарий

Plain text

  • HTML-теги не обрабатываются и показываются как обычный текст
  • Адреса страниц и электронной почты автоматически преобразуются в ссылки.
  • Строки и параграфы переносятся автоматически.

Filtered HTML

  • Адреса страниц и электронной почты автоматически преобразуются в ссылки.

Gmap