Токсическое воздействие восьми эндоцеллюлярных криопротекторов на срезы гиппокапма крыс. Пичугин Ю.И.

Было изучено сравнительное токсическое действие восьми криопротекторов на срезы гиппокампа крыс. Сравнение токсического действия осуществлялось в одинаковых условиях для всех испытанных веществ.

Сравнивались 60% (в/об) растворы криопротекторов при действии на срезы в течение 15 минут при -10°С. Выживаемость срезов определялась методом отношения концентрации ионов калия к концентрации ионов натрия как для обработанных, так и для необработанных, контрольных срезов. Изученные криопротекторы расположили в ряд по уменьшению процента выживаемости и соответственно по увеличению токсического действия на срезы гиппокампа крыс: этиленгликоль (66,3%), глицерин (60,0%), 1,2 пропандиол (31,5%), диметилформамид (25,9%), диметилсульфоксид (17,9%), диметилацетамид (8,2%), 2-метоксиэтанол (6,3%) и формамид (2,1%).

Данное исследование является частью научного проекта, целью которого был исчерпывающий поиск наилучших витрифицирующих смесей для криосохранения как мозговой ткани, так и целого мозга животных. Первым этапом работы было изучение токсических эффектов наиболее используемых проникающих, эндоцеллюлярных криопротекторов (Пичугин Ю.И., 1993) на срезах мозговой ткани крыс. Общеизвестно, что ведущим фактором в успешной витрификации органов и тканей является преодоление токсичности витрификационных смесей. В научной литературе не было найдено работ, посвященных изучению токсических эффектов криопротекторов на мозговую ткань животных, кроме одной (Pichugin Y., 2006), в которой сообщалось, что 30% (в/об) глицерин практически не токсичен для срезов гиппокампа крыс. Целью данной работы была количественная оценка токсических эффектов восьми, наиболее используемых эндоцеллюлярных криопротекторов: этиленгликоля, глицерина, 1,2 пропандиола, диметилформамида, диметилсульфоксида, диметилацетамида, 2-метоксиэтанола и формамида.

Большинство методик экспериментов были подробно описаны ранее (Pichugin Y., 2006). В работе использовались самцы крыс породы Вистар весом 200-300 грамм. Крысы анестезировались изофлураном в закрытой камере, затем умертвлялись избытком этого анестетика. Мозг крыс быстро извлекался и помещался в инкубационный раствор при 2-4°C. Правая и левая половинки гиппокампа выделялись из мозга под холодным инкубационным раствором. Каждая половинка гиппокампа была порезана на 7-9 поперечных срезов толщиной 0,475 мм с помощью устройства МакИлвейна для резки биологических тканей. Срезы помещались и инкубировались в течение 1 часа в инкубационной Осло-камере при температуре +33°C. Инкубационный раствор состоял из следующие компонентов: 124 мM NaCl, 5 мM KCl, 22 мM NaHCO3, 1.25 мM NaH2PO4, 1.25 мM MgSO4, 2 мM CaCl2, и 10 мM глюкозы. pH раствора устанавливалась и поддерживалась 7.4 с помощью карбогена (95% O2/5% CO2). После инкубационного восстановления 6-8 срезов брались на экспозицию с определенным криопротектором, а другие 6-8 срезов служили контролем, как необработанные срезы. Методика определения выживаемости срезов гиппокампа крыс по K+ /Na+ тесту подробно описана в работе (Pichugin Y., 2006). Транспортным раствором для криопротекторов служил RPS-2 раствор (Fahy G.M., 1995). Протокол экспозиции криопротекторов со срезами гиппокампа крыс был один и тот же для каждого криозащитного вещества:

% криопротектора4815306030+15+8+4++
Время экспозиции, мин.5102030455565707580
Время стадии, мин.551010151010555
Температура стадии, oС1010100-10010101010

где: % есть процентная (в/об) концентрация; + - означает добавление маннитола в концентрации 0,3 моля на литр; мин. – минуты; °С – температура в градусах Цельсия.

Важно постепенное введение криопротектора в мозговые срезы и такое же постепенное удаление его из ткани. Это позволяет избегать осмотических стрессов, как и добавление изотонического количества маннитола при отмывании срезов от криозащитных веществ. После 80- минутной экспозиции с криопротектором срезы гиппокампа снова помещались в инкубационную камеру для восстановления. Срезы брались для определения выживаемости K+ /Na+ тестом после 60-минутной восстановительной инкубации. Были изучены именно сравнительные токсические эффекты криопротекторов на срезы гиппокампа, то есть не было попыток оптимизировать условия экспозиции для каждого индивидуального вещества для увеличения выживаемости. Результаты исследования приведены в таблице.

Таблица.

Выживаемость срезов гиппокампа крыс после экспозиции с криопротекторами

Криопротектор% выживаемости
Этиленгликоль66.3±10.4
Глицерин60.0±5.8
1,2-пропандиол31.5±4.8
Диметилформамид25.9±4.0
Диметилсульфоксид17.9±2.6
Диметилацетамид8.2±1.6
2-метоксиэтанол6.3±1.8
Формамид2.1±0.5

Криопротекторы были использованы в одних и тех же экспериментальных условиях: конечные концентрации 60% (в/об), время экспозиции 15 минут при температуре -10°C (n=5, p = 0.05). Наименее токсичными для срезов гиппокампа крыс были этиленгликоль и глицерин, поэтому они могут быть использованы как основные компоненты витрификационных смесей с пониженной токсичностью. Однако следует принимать во внимание и витрификационную способность криопротекторов. В этом отношении глицерин намного проигрывает этиленгликолю и диметилсульфоксиду. Диметилсульфоксид, несмотря на его повышенную токсичность, часто используется в витрификационных смесях благодаря его высокой витрифицирующей способности (Fahy G.M., 2004). Диметилацетамид и формамид обладают высокой токсичностью, поэтому их не следует использовать в витрификационных смесях (Fahy G.M., 2002).

Литература

  1. Пичугин Ю.И. Итоги и перспективы поиска новых эндоцеллюлярных криопротекторов Проблемы криобиологии 2: 3-10, 1993.
  2. Fahy G.M., Mouta C., Tsonev L. Cellular injury associated with organ cryopreservation: chemical toxicity and cooling injury in: Cell Biology of Trauma, (J.J. Lemasters, C. Oliver, Eds.), RC Press, Boca Raton, 1995.
  3. Fahy G.M., Wowk B. Cryoprotectant solution containing dimethyl sulfoxide, an amide and ethylene glycol, United States Patent 6,395,467 B1 (2002).
  4. Fahy G.M., Wowk B., Wu J. Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances, Cryobiology 48: 157–178, 2004.
  5. Pichugin Y, Fahy GM, Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal slices by vitrification Cryobiology 52: 228-240, 2006.

 

Abstract
Comparative toxic effects of eight cryoprotective agents on rat hippocampal slices were studied. Comparison of the toxic effects was performed in the same experimental conditions for all of cryoprotectants. 60% (w/v) solutions of cryoprotectants were tested on the rat hippocampal slices for 15 minutes at - 10pC. Survival of the slices was tested by a method of ratio of potassium ion concentrations to sodium ion concentrations for both the treated slices and the untreated, control ones. Studied cryoprotectants were arranged in order of decreasing percentage of slice survival and accordingly in order of increasing the toxic effects: ethylene glycol (66,3%), glycerol (60,0%), 1,2 propanediol (31,5%), dimethylformamide (25,9%), dimethyl sulfoxide (17,9%), dimethylacetamide (8,2%), 2-methoxyethanol (6,3%) and formamide (2,1%).

Пичугин Ю.И., Токсическое действие восьми эндоцеллюлярных криопротекторов на срезы гиппокампа крыс. - Теоретические и практические аспекты современной криобиологии Материалы Международной заочной научно-практической конференции (24 марта 2014 г. Россия – Украина). – Сыктывкар, 2014, стр, 60-63