Перспективы создания криопротекторов на основе инертных газов и их смесей. Артюхов И.В.

Аннотация. Обсуждаются предположительные механизмы криопротекторного действия инертных газов. Обосновывается возможность использования их, их смесей и комбинаций с традиционными криопротекторами для сохранения биологических объектов и материалов, в частности, донорских органов для трансплантации. Намечаются направления дальнейших исследований.

Введение в проблематику. В настоящее время значительное количество серьёзных заболеваний (включая травмы) может быть вылечено с использованием трансплантации донорских органов взамен поражённых. Основными ограничениями при этом являются как общая нехватка органов для трансплантации, так и трудность подбора подходящего для конкретного пациента донорского органа. Последняя проблема связана с очень коротким сроком, в течении которого орган сохраняет жизнеспособность и пригоден для трансплантации. Этот срок составляет от нескольких часов до (в случае почки) одного, максимум двух дней. За это время чрезвычайно трудно в экстренном порядке подобрать более или менее совместимую пару донор- реципиент, подготовить реципиента к тяжёлой операции, практически невозможно проверить орган на различные инфекции.

Эту проблему можно было бы решить, если бы удалось продлить период сохранения органа в жизнеспособном состоянии как минимум, до месяцев, желательно – неограниченно долго. Это позволило бы создать сеть банков органов, подбирать каждому пациенту именно те органы и ткани, которые не отторгались бы его организмом, заранее без спешки проверять их на все значимые инфекции.

Такое сохранение возможно организовать с использованием глубокого охлаждения биологических объектов и материалов. На практике хорошо отработано криосохранение клеток, небольших сегментов тканей, эмбрионов человека. Для защиты их от повреждающего действия холода используются вещества-криопротекторы. Однако, существуют значительные трудности при криосохранении более крупных объектов – таких, как органы. В частности, использование традиционных криопротекторов (глицерин, ДМСО и др.) требует применения таких высоких концентраций, которые сами по себе обладают высокой токсичностью.

Ещё в 60-е годы XX века было предложено использовать в качестве криопротекторов инертные газы, в первую очередь, ксенон. Очевидным их преимуществом является сама химическая инертность – и, как следствие, отсутствие токсичности.

Механизмы криопротекторного действия инертных газов. Существует несколько механизмов повреждающего действия холода на живые клетки и ткани. Основные из них:

  1. Повреждение клеток (и, в меньшей мере, внеклеточного матрикса тканей) образующимися кристаллами льда. Этот механизм повреждения считается наиболее значимым; именно для ингибирования образования и роста кристаллов используются криопротекторы.
  2. Фазовый переход жидкий кристалл – гель в фосфолипидных мембранах клеток. Этот переход обратим, но при нём мембрана натягивается, становится более толстой и жёсткой (хрупкой), что может привести к её механическому повреждению, в том числе, и кристаллами льда.
  3. Денатурация белковых молекул. Она происходит как под действием собственно охлаждения, так и в результате дегидратации и воздействия возрастающих концентраций электролитов.

Использование инертных газов (конкретно, ксенона) в качестве криопротекторов впервые, видимо, было предложено Р. Прегодой ещё в 60- е годы XX века [1]. В последующие годы эта идея не привлекала большого внимания, и количество исследований в этом направлении было небольшим [2-4]. Практически всеми авторами высказывалось предположение, что криопротекторные свойства ксенона объясняются образованием кристаллогидрата ксенона, которое конкурирует с образованием кристаллов льда. Однако, никто до сих пор не показал, что кристаллы гидрата ксенона повреждают клетки и ткани меньще, чем кристаллы льда. Кроме того, криопротекторные свойства ксенона проявлялись уже при концентрациях, заведомо много меньших, чем необходимые для образования кристаллогидратов [3].

Нам представляется, что криопротекторные свойства ксенона могут объясняться следующими (не взаимоисключающими) механизмами:  Меньшим повреждающим действием кристаллов гидрата ксенона по сравнению с кристаллами льда которое, возможно, связано с различием в форме тех и других кристаллов (кристаллы льда могут иметь игловидную форму).

  • Образованием не кристаллического, а аморфного гидрата ксенона (существование аморфной формы гидрата продемонстрировано для другого газа – метана). Аморфные гидраты могут образовываться при значительно меньших концентрациях газов, чем те, которые необходимы для образования кристаллогидратов.
  • Накоплением молекул ксенона в рыхлом слое на границе вода- лёд, замедляющим рост кристаллов льда (Ice Blocking).
  • Мембранопротекторным действием ксенона. Предполагается, что гидрофобные молекулы ксенона могут накапливаться в мембранах клеток, понижая температуру их фазового перехода и увеличивая механическую эластичность мембран.
  • Ингибирование денатурации белков. Это может быть обусловлено повышением стабильности белковых молекул за счёт накопления молекул ксенона в гидрофобных «карманах» белков.

Нами был проведён большой объём вычислений с целью молекулярного моделирования взаимодействия молекул ксенона с водой и льдом при температурах вблизи 0°С и ниже. Методика моделирования и полученные результаты подробно описаны в работе []. Здесь мы приведём основные полученные выводы:

  1. Растворимость ксенона в воде очень быстро возрастает с понижением температуры.
  2. Гидратация ксенона происходит путём формирования кластеров Xe·H2On, где в среднем n 21.5.
  3. C возрастанием концентрации ксенона и с понижением температуры вязкость раствора возрастает. При температурах ~255–250°K вязкость растворов ксенона становится настолько высокой, что за время расчёта (~100 nsec) термодинамические параметры системы не успевают прийти к равновесию; это позволяет предположить возможность витрификации раствора при достаточно низких температурах, однако моделирование этого процесса потребует многократно больших расходов вычислительного времени.
  4. При достаточно высоких (>~3% mol) концентрациях растворённого в воде ксенона и температурах вблизи 0°С наблюдается очень быстрая (через ~20 nsec) гомогенная нуклеация клатратного кристаллогидрата ксенона со структурой sI (что соответствует экспериментальным данным).
  5. Ни в одном случае за время моделирования (до 100 nsec и больше) не наблюдалось гомогенной нуклеации льда; в тех случаях, когда в системе присутствовал как лёд, так и кристаллогидрат ксенона, рост кристаллов последнего происходил многократно быстрее.
  6. В ряде случаев наблюдалось образование метастабильной аморфной структуры с высоким (~6% mol) содержанием ксенона; парадоксальным образом этот аморфный гидрат ксенона кажется тем более устойчивым по отношению к образованию кристаллического гидрата, чем ниже температура.
  7. При моделировании двухфазной системы (H2O+Xe)/лёд (рис. 1) температура равновесия жидкость/лёд снижалась примерно на 1°С на каждый процент ксенона, что соответствует криоскопическому закону.


    Рис. 1. Равновесные состояния системы жидкость/лёд при концентрациях ксенона (a) 0%, (b) 1% и (c) 4%. Атомы кислорода показаны точками, ксенона – большими шариками.

  8. Мы наблюдали некоторое накопление молекул ксенона в пограничном слое вода-лёд (рис. 2), однако это не приводило к заметному замедлению роста кристалла льда, что противоречит гипотезе о связи криопротекторного действия ксенона с замедлением роста кристаллов льда по механизму Ice Blocking.
  9. При температурах ниже равновесной наблюдается рост кристалла льда. Он происходит до тех пор, пока концентрация ксенона в оставшейся воде не станет достаточно высокой, после чего там происходит гомогенная нуклеация кристаллогидрата либо не образуется аморфный гидрат, после чего рост кристалла льда останавливается (рис. 3).

Таким образом, использование инертных газов в качестве криопротекторов может позволить затормозить образование и рост кристаллов льда и, возможно даже, достичь витрификации живой ткани. Для этого могут потребоваться весьма высокие их концентрации, но в силу самой инертности газов они не будут обладать токсичностью и могут быть использованы в нужных концентрациях; требующиеся для этого давления не слишком высоки и не приведут к снижению жизнеспособности клеток и тканей.


Рис. 2. Распределение атомов кислорода (синий и зелёный цвета) и ксенона (красный цвет; масштаб по шкале Y увеличен в 40 раз для того, чтобы сопоставить его с плотностью молекул воды) при разных условиях. Слева – кристалл льда (атомы кислорода строго упорядочены; ксенон отсутствует). Справа – жидкая фаза. Видно образование слоёв с повышенной концентрацией молекул ксенона в пограничном слое лёд/жидкость. Кроме ксенона могут быть использованы и другие инертные газы; их молекулярный размер может оказаться более подходящим для заполнения полостей, образующихся на границе вода-лёд. Также может оказаться выгодным использование смесей инертных газов для оптимального заполнения всего спектра образующихся полостей. Использование отличных от ксенона газов может потребовать применения более высоких (но приемлемых) давлений.

Направления дальнейших исследований

Для оптимизации состава газовых смесей и режимов их применения при криосохранении различных органов и тканей должны быть проведены следующие исследования, как теоретические (молекулярное моделирование), так и экспериментальные:

  1. Исследование образования гидратов других (кроме ксенона) инертных газов.
  2. Исследование образования гидратов с использованием смесей газов.
  3. Исследование взаимодействия вода-газ при более низких температурах (потребует бульшего объёма вычислений).
  4. Исследование совместного применения газовых и традиционных криопротекторов.
  5. Исследование взаимодействия инертных газов с клеточными мембранами.
  6. Исследование взаимодействия инертных газов с молекулами белков. Проведение этих исследований позволит разработать для каждого органа оптимальный состав криопротекторов и режим охлаждения- согревания.

Рис.3. Конечные состояния системы жидкость/лёд при концентрациях ксенона (a) 1%, (b) и (c) 4%. В случаях (а) и (с) образуется слой аморфного гидрата ксенона; в случае (b) происходит гомогенная нуклеация кристаллогидрата, что следует из наличия плато на графике потенциальной энергии системы, показанном на врезке.

Выводы. Использование криопротекторов на основе ксенона и других инертных газов (вероятно, в сочетании с другими криопротекторами в малотоксичных концентрациях) может позволить осуществить долговременное – от месяцев до многих десятилетий – сохранение биологических объектов, включая органы для трансплантации. Разработка оптимальных составов криопротекторов и режимов охлаждения-согревания для различных органов потребует большого объёма дальнейших исследований.

Литература

  1. Artyukhov V.I. et al., «Can xenon in water inhibit ice growth? Molecular dynamics of phase transitions in water–Xe system». В печати.
  2. Prehoda, R.W. «Suspended Animation», Chilton Book Company, 1969.
  3. Rodin, V.V., F.S. Isangalin, et al. (1984). «Structure of protein solutions in a presence of xenon clathrate». Cryobiology & Cryo-Medicine 14: 3-7.
  4. Sheleg, S., H. Hixon, et al. (2008). “Cardiac Mitochondria l Membrane Stability after Deep Hypothermia using a Xenon Clathrate Cryostasis Protocol - an Electron Microscopy Study.” International Journal of Clinical and Experimental Pathology 1(5): 440-447.
  5. Щербаков П.В., Тельпухов В.И., Николаев А.В. Патент (19) RU(11) 2 268 590 С1 (51) МПК A01N 1/02 (2006.01). Способ криоконсервации органов и тканей in situ.
  6. Яковлев Е.И. «Трубопроводный транспорт продуктов разработки газоконденсатных месторождений». М.: Недра, 1990.

 

Артюхов И.В., Перспективы создания криопротекторов на основе инертных газоы и их смесей, - Теоретические и практические аспекты современной криобиологии Материалы Международной заочной научно-практической конференции (24 марта 2014 г. Россия – Украина). – Сыктывкар, 2014, стр, 88-94